A pesar del creciente desarrollo de los géneros profanos, la música compuesta para la Iglesia continuó siendo en esta época la de mayor altura.
Debido a la solemnidad de su función, su carácter es siempre noble; y, por otro lado, a ella pertenece la forma musical más ambiciosa, por su extensión y complejidad, del todo el Renacimiento: la Misa.
Un acontecimiento histórico influyó de forma decisiva sobre la música religiosa renacentista: el cisma originado por la Reforma Protestante, que escindió a la Iglesia de Occidente y provocó la reacción contrarreformista, emanada del Concilio de Trento. En este concilio, reunido para definir claramente la doctrina católica frente a las tesis protestantes y restablecer la disciplina de la Iglesia, se dictaron normas respecto a la música, como, en general, respecto a todo el arte religioso. Para conseguir una mayor espiritualidad y austeridad en el culto, se insistió en la eliminación de todo aspecto profano, irreverente, o simplemente inadecuado a su elevada función. La música debía expresar fielmente el espíritu del texto e
invitar al recogimiento y la oración. Por descontado, las palabras del texto debían ser perfectamente inteligibles para el oyente. Esta última disposición originó una agitada polémica, ya que se planteó incluso la posibilidad de prohibir el estilo polifónico con el argumento de que dificultaba la comprensión del texto. Además, se insistió en que debía evitarse el uso de distintos instrumentos en la iglesia.
Las dos grandes formas de la música de la música religiosa del Renacimiento son la Misa y el Motete. El Oficio Divino se pone en música mucho menos frecuentemente (aunque hay excepciones importantes, como el Oficio de Semana Santa de Tomás Luis de Victoria) y, cuando se hace, se suelen preferir algunas partes aisladas, como el cántico del Magnificat, que siguió siendo muy popular por su vinculación a la Virgen María, y algunos himnos sueltos, como el Te Deum.
Por lo que se refiere a la Misa, en el Renacimiento se consolida la costumbre de poner música sólo a las partes del Ordinario. Entre éstas, las que tienen texto corto (Kyrie, Sanctus y Agnus Dei) se componían empleando la técnica del contrapunto imitativo, con extensos melismas, lo que permitía prolongar su duración. Para el Gloria y el Credo, cuyo texto es largo, se utiliza, por el contrario, un estilo silábico en el que las voces no se imitan tanto entre sí, sino que avanzan paralelamente, emitiendo sonoridades verticales equivalentes a los futuros acordes del estilo homofónico.
El Motete es una composición coral a capella, de breve duración (de cuatro a ocho minutos) sobre un texto religioso no litúrgico, normalmente uno o dos versículos tomados de la Sagrada Escritura. No obedecía a una estructura fija, siendo lo habitual que a cada frase correspondiese una sección melódica distinta. Su carácter es serio y solemne y, formalmente, no se diferencia en nada de una de las partes breves el Ordinario de la Misa. Sin embargo, al tratarse de textos variados, el compositor gozaba de mayor libertad para la invención. Por esta razón y por lo apropiada que resultaba su interpretación en todo tipo de ceremonias, se compusieron muchísimos motetes.
Entre los más importantes compositores de misas y motetes destaca Palestrina, que representa como ningún otro la tradición y el carácter de la música contrarreformista. Casi toda su producción fue religiosa, de una elevada espiritualidad, austera e imponente. Trabajó como director de coro en la Capilla Julia, en el Vaticano, y después en el Seminario de la Compañía de Jesús. Su obra más recordada hoy es la Misa del Papa Marcello.
Los españoles Cristóbal de Morales, Tomás Luis de Victoria y Francisco Guerrero fueron también grandes compositores de misas y motetes en el estilo romano. Los dos primeros pasaron muchos años en Roma, donde publicaron algunas de sus obras y gozaron de gran aprecio.
Dos obras de Victoria se señalan especialmente como cimas de la música renacentista: el Oficio de Semana Santa y la Misa de Réquiem para la emperatriz María. La monumentalidad de su música es comparable a la de Palestrina, pero hay además en ella una cualidad de apasionado misticismo que lo acerca espiritualmente a la obra de sus ilustres contemporáneos, Santa Teresa de Jesús y San Juan de la Cruz.
Es también muy importante la producción religiosa de Orlando di Lasso, compositor de origen francés que, como Morales y Victoria, viajó y estudió en Italia (costumbre muy extendida entre los artistas de su época) y en cuya obra sintetiza la complicada técnica polifónica de los Países Bajos y la dulzura de la música italiana.
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